自考基因工程04353复习资料（4）

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第七节核酸外切酶

1.核酸外（Exonucleases）切酶

定义:一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核苷酸的酶。

分类：单链的核酸外切酶

双链的核酸外切酶

第八节核酸内切酶

1.S1核酸酶

(1)特点：

活性：降解单链核酸（DNA或RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区

(2)S1核酸酶的应用----RNA分子的定位

2.Bal31核酸酶

Bal31核酸酶的三种活性：

（1）单链核酸内切

（2）双链核酸外切

（3）双链切口对应链

Bal31核酸酶主要用途：

（1）诱发DNA发生缺失突变

（2）定位测定DNA片断中限制性位点的分布

（3）研究超盘旋DNA分子的二级结构

3.其他核酸酶

外切核酸酶Ⅲ（ExonucleaseⅢ）：3’至5’外切

RNA酶Ⅰ(RNaseⅠ)：切割DNA-RNA杂合链中的RNA

其他核酸酶:

外切核酸酶Ⅲ（ExonucleaseⅢ）：3’至5’外切

DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）：随机切割ss&dsDNA

RNA酶Ⅰ(RNaseⅠ)：切割DNA-RNA杂合链中的RNA

第三章Techniques基因工程技术

Outline

1、电泳

2、分子杂交

3、转化与转染

4、核酸测序

5、DNA扩增---PCR

6、核酸-蛋白相互作用

第一节电泳

原理：通过电场的作用使带电的大分子在电泳介质中运动。

目的：根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同的分子（依据不同的凝胶体系）。

电泳的分类：

琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis），

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）

琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）

ds-DNA

目的：

分离不同长度的DNA片段

a.确定DNA片段的长度

b.确定DNA的有无与多少

c.分析酶切产物

凝胶电泳的原理:略

电泳步骤

第一步：制胶

第二步：样品制备

第三步：点样

第四步：跑电泳

第五步：紫外灯下检测，拍照

第六步：数据处理

缓冲体系：

TAE,pH 8.0,~50 mM-Tris,Acetate,EDTA

TBE,pH 8.0,~50 mM-Tris,Borate,EDTA

影响迁移率的因素：

凝胶的孔径

电压

DNA片段长度及结构

EB的影响

分辨率影响因素：

琼脂糖浓度

缓冲液或样品的盐离子浓度

核酸上样量

电压

聚丙烯酰胺凝胶电泳（poly-acrylamide gel electrophoresis，PAGE）

范围：短片段分辨率：1bp

类型：

变性胶（长度）、

非变性胶（长度、构型）

变性胶：1、含尿素；2、DNA样品经甲酰胺与热处理；3、电泳保持温度。

Agarose与PAGE的不同：

分辨率

操作

应用：RFLP,AFLP,DD-PCR,sequencing,primer extension,S1 mapping,RNase protection assay…