自考基因工程04353复习资料（1）

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第二章Enzymes

第四节DNA连接酶Ligase

一、DNA连接酶的发现

二.连接条件

必须是两条双链DNA。

DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。

三、连接反应的机理

1、ATP（NAD+)提供激活的AMP。

2、ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。

3、AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。

4、AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。

5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。

Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口”

四.两种DNA连接酶

1.E.Coli DNA ligase

来源：E.coli

适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端）

2.T4 ligase

来源：T4 phage

适用：粘性末端及平末端

T4 vs.E.coli

T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！

五.Ligase的反应温度

最佳温度：

界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。

六.DNA分子连接的四种形式

1.粘性末端；2.平末端；3.平末端加尾；4.平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor)

(1)Digestion and Ligation

1．粘性末端连接

Problem:(自我环化作用)

解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸

2.平末端连接

粘性末端连接效率高于平末端约100倍！

解决方法：化平末端为粘性末端

3.平末端连接---同聚物加尾法

（1）末端脱氧核苷酸转移酶

功能：5’至3’单链聚合

作用特点：单链；无模版

作用机理：

a:用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸,获得3’-OH的单链延伸末端。

b:加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。

c:获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。

缺点：

当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。

需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。