自考基因工程04353复习资料（5）

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第二节分子杂交

一.分子杂交概述

(1)定义

分子杂交（molecularhybridization）：不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统称为分子杂交技术。

(2)用途

形成DNA／DNA(DNA／RNA)杂种分子，可以用来

a.检测特定生物体之间的亲缘关系。

b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

c.对目的基因进行相对定量。

d.对特定蛋白质进行定性及定量分析

(3)杂交的基本步骤

以核酸分子杂交为例：

凝胶电泳分离的DNA/RNA

吸印,转膜(通过毛细管作用或电导作用)

探针标记

杂交

检测

(4).种类

Southern:DNA-DNA

Northern:DNA-RNA

Western:Pr-Pr

二.Southern blotting

1.Southern Blotting

(1)目的：检测特定DNA序列。

(2)原理：电泳分离DNA，并将之转至尼龙膜上，以标记好的探针（DNA）与之杂交。

(3)步骤Protocols

a.基因组DNA制备

b.DNA酶切消化

c.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断

d.碱变性，中和

e.转移DNA到固相支持物(如，尼龙膜)

f.杂交反应

g.放射自显影

h.数据分析

2.Other DNA analyses

（1）斑点杂交(dot blotting)与狭线杂交(slot blotting)

（2）菌落与噬菌斑杂交

(1)Dot blotting,slot blottlng:

将样品直接有规律地排列成点阵或线阵，然后进行杂交检测。多用于病原体基因检测，如微生物的基因。

(2)菌落与噬菌斑杂交（过程略）

三.Northern blotting

1.Northern Blotting

(1)目的：检测特定序列的RNA的长度与丰度。

(2)原理：电泳分离RNA，并将之转至尼龙膜上（blot)，以标记好的探针（DNA）与之杂交。

实验过程基本上同Southern

Southern blot和Northern blot区别：

1）RNA分子较小，不需进行限制性内切酶切割；

2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团；

3）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱；

4）在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合；

5）操作均应避免RNase的污染。

(2)Ribonuclease protection assay过程：

RNA和探针在液体混合物中杂交.

未杂交上的RNA和探针被核酸酶降解，这种核酸酶只识别单链RNA。

杂交后的探针和RNA复合体通过琼脂糖凝胶电泳分离。

转膜，放射自显影。

RPA有Northern Blot无法比拟的优势：

过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全。

RPA比Northern Blot灵敏15－150倍，适合检测各种表达水平之基因。

RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达。

一次RPA就能完成10多次Northern Blot的工作，加快研究速度。

主要缺点：

RNA探针的制备麻烦。

核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，X片上什么都没有。

(3)Reverse Northern blotting