自考基因工程04353复习资料（2）

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4.平末端连接

---衔接物连接法与接头连接法

(1)平末端的衔接物连接法

衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。

(2)平末端的接头连接法

将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。

七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌

热稳定的DNA连接酶的应用：

寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay,OLA）

连接酶链式反应（ligation chain reaction,LCR）

寡核苷酸连接测定法的作用

检测突变

寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。

1.寡核苷酸连接测定法

（1）原理:

两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。

当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。

结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。

第五节DNA聚合酶DNA Polymerase

常用的DNA聚合酶：

1、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ

2、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段酶

3、T4 DNA聚合酶

4、T7 DNA聚合酶

5、反转录酶等。

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ特点

活性：5’3’聚合低

5’3’外切有

3’5’外切低

DNA聚合酶Ⅰ的应用——放射性探针的标记

(1)DNA聚合酶Ⅰ的两种特殊反应：

切口转移与链取代

(2)切口转移法制备放射性DNA分子杂交探针

二、Klenow片段

1、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段

活性：

5’3’聚合低

5’3’外切无！

3’5’外切低

2.Klenow片段的应用

末端补平

末端标记及随机引物标记

cDNA第二链合成（见cDNA文库构建）

DNA测序