自考基因工程04353复习资料（3）

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三.T4 DNA聚合酶

1.T4 DNA聚合酶特点

活性：

5’3’聚合低

5’3’外切无

3’5’外切高！

2.T4 DNA聚合酶活性的条件

模版、引物、原料dNTP

3.T4 DNA聚合酶的“取代合成”法末端标记

四.T7 DNA聚合酶

1.T7 DNA聚合酶特点

活性：

5’3’聚合高！

5’3’外切无

3’5’外切高

2.T7 DNA聚合酶的应用

合成：高活性，几kb，不受DNA二级结构的影响

标记：类似T4（取代合成）

末端补平：类似T4

第六节核酸修饰酶

一.修饰的T7 DNA聚合酶

活性：

5’3’聚合更高(*3)！

5’3’外切无

3’5’外切无！

修饰的T7 DNA聚合酶的应用：

合成能力：更高、更快、更强！

标记：重在“掺”与

末端补平：

二.激酶(kinase)&磷酸酶(phosphotase)

T4多核苷酸激酶

(1)特点

来源：T4噬菌体pseT基因编码；

活性：5’-OH加磷酸；

(2)T4 kinase 5’末端标记的机理

用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使5‘OH基国暴露，同多核苷酸激酶从r-P ATP分子中转移来的r-P基团键合，实现末端标记。

(3)T4多核苷酸激酶的应用

a:5’末端标记

b:5’末端磷酸化

磷酸酶

(1)特点

来源：细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphotase，BAP)，E.coli；小牛肠碱性磷酸酶（Calf intestinal Alkaline Phosphotase,CIAP)，小牛肠。

活性：5’-P去磷酸

(2)磷酸酶作用机理

催化核酸分子脱掉5‘－P，使DNA分子5’－P转化成5‘－OH－－－脱磷酸作用。

这样产生的5‘－OH末端，为随后在[r-P]ATP和T4多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。

(3)磷酸酶的应用

末端标记前处理

防止DNA分子自身环化

(4)BAP与CIAP比较

热稳定性（65℃）BAP：active CIAP：30min失活